3、胰岛素和胰岛素原测定：除空腹及发作时血糖低于2.2mmol/L（40mg/dl）外，可采用下列试验：
（1）空腹发作时血浆胰岛素测定：正常人空腹静脉血浆胰岛素浓度，一般在5～20mU/L范畴内，很少超过30mU/L，但本病常有自主性分泌的高胰岛素血症，当病人于清晨空腹12～14h后约80％者可出现低血糖症并伴相对较高的血浆高胰岛素水平，对既有低血糖症又有高胰岛素血症的病人，血浆C肽测定有助于区分外源性胰岛素引起的人为的医源性低血糖症，胰岛素瘤95％患者C肽水平≥300pmol/L，然而低血糖症由于磺脲类药物引起者，不能用C肽测定排除，尿中这些药物的检测是必须的，但肥胖症，肢端肥大症，皮质醇增多症，妊娠后期，口服避孕药等可致高胰岛素血症，胰岛β细胞瘤性低血糖时，大多数胰岛素原水平升高，尤其是低血糖病人在测定胰岛素和C肽数据出现不一致时，测定胰岛素原是非常必要的，对鉴别内源性胰岛素和外源性胰岛素所致低血糖症是有诊断价值的，但不能仅仅胰岛素原升高，而做出低血糖症的诊断，C肽和胰岛素同时分泌，且C肽具有抗原性，故利用放射免疫法测定C肽可反映胰岛细胞的分泌功能，胰岛素瘤或胰岛B细胞增生时血清和尿C肽增加，由于外源性胰岛素不含C肽，不会干扰C肽测定，故在用胰岛素治疗的糖尿病患者如同时有胰岛素瘤，本试验有很大价值。
（2）胰岛素释放试验：甲苯磺丁脲（D860）试验可刺激胰岛释放胰岛素，产生持续3～5h的明显低血糖，正常人空腹时静脉注射1g的D860（或按20～25mg/kg溶于生理盐水20ml中静脉注射）于5min时引起短暂的血浆胰岛素升高至60～130μu/ml，20～30min后血糖逐渐降低，1.5～2h即可恢复正常，而胰岛素瘤病人注射后5～15分钟时反应加强，且2～3h后低血糖仍不恢复，肿瘤切除后，此种异常反应即消失，以判断胰岛β细胞功能状态，由于胰岛素瘤分泌胰岛素可以是间歇性的，可疑病人需要定期重新检查，各种疾病患者的糖耐量曲线可显著不同。