根据病史和临床表现怀疑真菌性巩膜炎应立即进行实验室检查。角膜或巩膜区刮片行革兰染色或姬姆萨染色可显示真菌的形态(有隔膜的菌丝碎片),革兰染色检出率约55%姬姆萨染色检出率约66%。确诊需培养出真菌。培养真菌需时较长,为提高培养的阳性率,同时接种几种不同的培养基。常用的真菌培养基如萨布罗葡萄糖琼脂适合真菌生长,血琼脂培养基适宜多数酵母菌,二态真菌在37℃孵箱中生长,巧克力琼脂、心-脑浸出液(BHI)培养基适宜抗酸真菌生长,Thioglycolate培养基适宜分枝杆菌生长。用2个培养盘,一个在室温下培养,另一个在35℃常规培养真菌。 如果角膜发生匐行性改变,有真菌性角巩膜炎的临床表现,真菌培养和巩膜或角巩膜活检阴性,对广谱抗生素治疗无效,真菌可通过完整的Descemet膜侵入前房,引起前房积脓,角膜尚未穿孔时行前房穿刺,立即用血琼脂或SDA、或BHI室温培养,以确定真菌。但前房穿刺时的创口可能将细菌等微生物接种于前房,必须慎重。